前言

(资料图片仅供参考)

固有免疫系统维持着一种完美的平衡，在健康组织中保持静止，而面对致病性刺激时可以迅速激活。巨噬细胞是固有免疫系统的关键效应分子，随时检测着激活和抑制信号，以启动吞噬和分泌细胞因子的功能。

细胞表面蛋白CD47是一种“不要吃我”的信号，它保护健康细胞不被巨噬细胞吞噬，缺乏CD47的造血细胞会被巨噬细胞迅速吞噬并触发树突状细胞的活化。CD47在癌细胞上的表达通常会增加，作为逃避免疫检测的一种机制。CD47的阻断性抗体会抑制肿瘤的生长甚至彻底清除肿瘤。靶细胞表面的CD47会被巨噬细胞或树突状细胞上的SIRPA（信号调节蛋白⍺）识别。SIRPA是一种含有多重细胞内基于酪氨酸的免疫抑制基序（ITIMs）的抑制性受体。缺乏SIRPA的巨噬细胞对携带CD47的靶细胞的吞噬作用不明显，这表明SIRPA是CD47信号的主要感受器。SIRPA必须以高度精确的方式来激活，以保证在CD47存在时抑制对活细胞的吞噬，而对缺乏CD47的靶点进行强有力的吞噬。CD47通过Src家族的激酶触发SIRPA磷酸化，磷酸化的SIRPA招募磷酸酶SHP－1和SHP－2，但是CD47如何驱动SIRPA磷酸化以及这些磷酸酶的下游靶点及其与吞噬过程的关系还不清楚。了解CD47－SIRPA抑制吞噬的作用机制对癌症免疫治疗的应用具有重要意义。CD47抑制IgG和磷脂酰丝氨酸“吃我”信号

为了研究吞噬过程中“吃我”和“不要吃我”信号整合的机制，研究人员使用了一个重组的吞噬靶标。这个靶标是将硅珠包裹在一个支持的脂质双层膜上，以模拟癌细胞的表面。为了激活SIRPA，研究人员将CD47胞外结构域按一定的密度（～600分子／mm2）整合来模拟癌细胞上的CD47。

利用这个系统，测试了CD47对IgG和磷脂酰丝氨酸的吞噬作用。可以发现CD47抑制了中等IgG密度下的吞噬，但对高密度结合IgG的靶标吞噬作用并不明显。CD47的存在并没有完全消除吞噬作用，而是导致开始吞噬的细胞比例和每个细胞被吞噬的小球数量的数量减少。这种抑制依赖于CD47的激活，因为突变的CD47胞外结构域不能与SIRPA结合（F37D，T115K），无法抑制吞噬。另外，含有10％磷脂酰丝氨酸的珠子的吞噬被包含在脂质双层上的CD47抑制。这些数据表明CD47－SIRPA信号可以阻断IgG和磷脂酰丝氨酸驱动的吞噬。CD47使SIRPA重新定位于吞噬突触

为了确定CD47调节SIRPA活性的机制，研究人员首先检查了SIRPA在IgG包被小球吞噬过程中的定位。当SIRPA不与CD47结合时，SIRPA与包裹IgG包被小球的吞噬杯分离。相反，在CD47的存在下，SIRPA仍停留在吞噬杯中。这些数据表明，未结合的SIRPA被排除在吞噬突触之外，而CD47结合SIRPA后使其仍保留在吞噬突触中。

在IgG和CD47缺失的情况下SIRPA从吞噬杯中分离的机制推测可能是由SIRPA高度糖基化的胞外结构域驱动的。为了验证这个想法，研究人员创建了一个SIRPA嵌合受体，其中胞外域被一个小的惰性蛋白结构域取代（FRBEXTT－SIRPA）。与全长SIRPA不同，FRBEXT－SIRPA没有与细胞靶向突触分离。这一结果表明SIRPA的胞外结构域是将SIRPA排除在吞噬突出之外所必需的。

SIRPA集中在免疫突触抑制吞噬

SIRPA包含两个免疫酪氨酸抑制基序（ITIMs），它们被Src家族激酶磷酸化，对下游信号传递至关重要。因此，可以推测将SIRPA定位在吞噬杯中可能驱动ITIM磷酸化和受体激活。为了区分CD47结合和突触定位的影响，研究人员开发了一种嵌合SIRPA受体，将SIRPA胞外结构域替换为FcgR3a链的IgG结合胞外结构域（FcR3EXT SIRPAINT），在CD47缺失的情况下定位于吞噬突触。这种突触定位嵌合体的表达抑制了IgG包被小球的吞噬。

作为对照，研究人员另外表达了一个嵌合结构，其中ITIM结构域的四个酪氨酸突变为苯丙氨酸，抑制了SIRPA的磷酸化和激活（FcR3ext SIRPA 4Fint）。这种结构不影响吞噬，表明SIRPA嵌合体的抑制作用是信号依赖的。因此，将SIRPA定位到吞噬杯足以抑制吞噬，即使在缺乏其天然配体CD47的情况下。

CD47抑制整合素活化

通过观察巨噬细胞登陆脂质双层膜的动力学，可以发现，IgG涂层的双层膜上的细胞遍布双层膜表面。相反，巨噬细胞遇到含有IgG和CD47的双层膜时，细胞扩散减少。静态时间点的TIRF成像显示，与含野生型CD47的双层膜相互作用的巨噬细胞较少，相互作用的巨噬细胞足迹较小。这些数据表明，CD47抑制了巨噬细胞在靶向底物上的扩散。

细胞扩散被认为涉及整合素和肌动蛋白细胞骨架的激活。未激活的整合素以低亲和力、弯曲的形式存在。激活后，整合素的胞外结构域会扩展为开放构象，可结合许多具有高亲和力的配体。FcR激活会刺激整合素的由内而外的活化。激活的整合素可通过增加与靶粒子的粘附力或提供细胞内信号和肌动蛋白组装来促进吞噬。通过用β2整合素功能阻断性抗体或Fab抑制整合素可显著降低IgG介导的吞噬效率。

CD47－SIRPA信号是否是通过抑制整合素由内到外的激活来抑制吞噬呢？为了验证这个想法，科研人员利用锰来处理巨噬细胞，而锰会将整合素锁定为高亲和力的开放构象。

结果发现，无论CD47是否与支持的脂质双层膜结合，用1 mM锰包被的小球处理的巨噬细胞具有相似的效率。重要的是，锰本身不会引发吞噬，也不会在缺乏CD47的情况下显著增强IgG包被小球的吞噬，从而证明增加整合素的活化以引发吞噬。因此，锰引起的吞噬增加对含有CD47和IgG的小球是特异的。

另一方面，通过用含有过量高亲和力整合素配体ICAM－1的小球培养巨噬细胞。即使在CD47存在的情况下，ICAM－1也足以激活整合素，高浓度ICAM－1的加入消除了CD47对吞噬的抑制作用，但在没有CD47的情况下，并没有显著改变IgG包被小球的吞噬效率。尽管存在CD47，但ICAM－1结合的珠子与缺乏CD47的珠子具有相似的肌动蛋白积累水平。这表明激活整合素可以恢复巨噬细胞吞噬的能力。综上所述，这些数据表明整合素的由内而外的激活可能是CD47－SIRPA参与后抑制的主要靶点。

整合素激活导致癌细胞吞噬

许多癌细胞尽管“吃我”信号的表达增加，如钙网蛋白或磷脂酰丝氨酸，但是它们可以增加CD47的过表达而逃避免疫吞噬。通过上面的试验我们可以发现，整合素在CD47的抑制吞噬的功能中发挥了关键的作用，那么直接激活整合素是否可以绕过癌细胞表面的CD47信号，使肿瘤细胞可以被吞噬呢？

为了验证这一点，研究人员将表达膜连接GFP（GFP－CAAX）的骨髓源性小鼠巨噬细胞与CD47阳性小鼠白血病细胞系L1210（表达核H2B－mCherry）进行孵育。通过对巨噬细胞与癌细胞相互作用成像8小时后，发现用100 mM锰激活整合素可提高巨噬细胞吞噬癌细胞的能力，达到与使用CD47功能阻断抗体治疗类似的效果。在这个实验过程中，锰并没有直接影响癌细胞的存活率，而是增加了巨噬细胞的吞噬率。这个数据表明激活整合素可以绕过癌细胞表面的抑制性CD47信号。

国内外针对CD47－SIRPa靶点的布局

目前，一些CD47靶向抗体或药物已进入临床试验，如下表所示，包括Hu5F9－G4（Forty－Seven）、CC－90002（Celgene）、TTI－621（Trillium）、ALX148（Alexo Therapeutics）、SRF231（Surface Oncology）、SHR－1603（恒瑞）和IBI188（Innovent Biologics）等。

其中Hu5F9－G4、CC－90002和IBI188是抗CD47抗体，TTI－621和ALX148是SIRPα－Fc融合蛋白。Advani等人招募22例淋巴瘤患者（15例为DLBCL，7例为滤泡性淋巴瘤，95％为利妥昔单抗难治）进行1b期临床试验；在侵袭性和惰性淋巴瘤患者中，加入利妥昔单抗可增强Hu5F9－G4相关的吞噬功能；此外，接受治疗的患者出现的不良反应（如贫血、恶心、腹泻和输液相关反应）仅在最初几周出现，在试验的后期，临床安全性事件并未显著增加。最近的研究也提出了另一种方法，通过使用miRNA抑制来减少CD47的表达并减缓肿瘤细胞的生长。考虑到miR－708与CD47之间存在负相关，miR－708表达的恢复可以调节CD47的表达。此外，miR－708和抗CD47抗体治疗的联合应用可提高巨噬细胞对白血病CEM细胞的吞噬活性，因此可在未来的研究中用作组合抗白血病治疗。

小结

CD47－SIRPA信号抑制吞噬，保护活细胞，但是癌细胞也会利用它逃避固有免疫系统。尽管CD47阻滞剂是一种很有前途的癌症治疗新靶点，但关于CD47－SIRPA的机制和效力还有许多未解决的问题。这项研究通过完整的试验表明，将SIRPA定位于吞噬突触足以激活这种抑制性受体，而一旦激活，SIRPA则通过阻止整合素激活来抑制吞噬。整合素在CD47－SIRPA功能轴中发挥了关键的作用。

尽管抗CD47治疗对癌症进展影响的研究结果令人鼓舞，但抗CD47治疗的有效性因癌症类型和不同的研究而不同；换句话说，抗CD47的疗效可能是肿瘤特异性的。不同肿瘤类型之间的反应可能是由于以下方面的差异：（i）药物输送方式（路径、载体、频率、效率）；（ii）肿瘤细胞内的药物的区域化分布；（iii）癌症进展阶段；（iv）免疫系统的能力；（v）获得性耐药。导致耐药性的潜在因素包括（但不限于）肿瘤异质性、肿瘤微环境的变化、药物失活、肿瘤细胞药物吸收减少或药物释放增加、肿瘤细胞存活途径的激活和表观遗传变化。在临床前研究中，癌症类型和个体研究对抗CD47治疗反应的差异也可能是由于肿瘤模型类型的差异造成的。例如，迄今已发表的许多研究使用异种移植瘤模型，而使用同基因肿瘤模型的研究较少；未来的研究应致力于开发和利用尽可能符合人类肿瘤病理学的肿瘤模型。

参考文献：

1． CD47 Ligation Repositions the Inhibitory Receptor SIRPA to Suppress Integrin Activation and Phagocytosis． Immunity． 2020 Aug 18；53（2）：290－302．e6．

2． Advances in Anti－Tumor Treatments Targeting the CD47／SIRPα Axis． Front Immunol． 2020； 11： 18．